Khám phá khởi nguồn từ những giọt dầu

Công nghệ PCR hiện nay đã phát triển đến thế hệ thứ 3 – thế hệ kỹ thuật số, có khả năng ứng dụng trong khám phá những lĩnh vực nghiên cứu mới mà trước đây chưa từng làm được. Droplet Digital PCR (ddPCR) là công nghệ PCR kỹ thuật số độc quyền của Bio-Rad. Với độ chính xác cao, ddPCR định lượng tuyệt đối các phân tử DNA, RNA mục tiêu mà không cần dùng đường chuẩn. Thông qua việc chia nhỏ thể mẫu và phân tích thống kê việc phát hiện các mục tiêu theo từng phần, hệ thống QX200 ddPCR sử dụng công nghệ vi lưu (microfluidic) tiên tiến để đạt được khả năng tạo giọt lớn (khoảng 20.000 giọt) với độ đồng đều cao trên mỗi mẫu cùng thao tác đơn giản. Vậy, việc sử dụng ddPCR sẽ đem đến những đột phá và hiệu quả ra sao?

1. Quy trình linh hoạt, mở rộng

Hệ thống được thiết kế đơn giản, thân thiện với người sử dụng và có thể dễ dàng nâng cấp từ chạy 8 mẫu cùng lúc lên chạy 96 mẫu chỉ trong 5 giờ. Hệ thống QX200 của Bio-Rad kết hợp công nghệ nhũ tương dầu – nước với hệ thống kênh dẫn vi lưu. Hệ thống này bao gồm 2 thiết bị chính: máy tạo giọt và máy đọc giọt cùng các thiết bị phụ trợ liên quan. Máy tạo giọt phân chia mỗi mẫu thành 20.000 giọt có kích thước nano, trong đó, các phân tử axit nucleic được phân chia hoàn toàn ngẫu nhiên vào các giọt. Mỗi giọt sẽ xảy ra phản ứng riêng. Các giọt được chuyển vào đĩa PCR 96 giếng và quá trình khuếch đại xảy ra trong máy PCR. Luồng dòng chảy các giọt đơn được phân tích huỳnh quang khi đi qua máy đọc. Các giọt dương tính là các giọt chứa ít nhất một bản copy của phân tử DNA hoặc RNA mục tiêu, phát huỳnh quang nhiều hơn so với các giọt âm tính. Sự phân chia của phân tử mục tiêu vào các giọt dương tính được định lượng bằng phương pháp Poisson.

Hệ thống QX200 có thể sử dụng linh hoạt mẫu dò thủy phân và các chất phát hiện huỳnh quang EvaGreen. Hệ thống được thiết kế linh hoạt, cho phép thông lượng mẫu đầu vào cao và độ nhạy phát hiện lớn.

2. Định lượng chỉ thị sinh học cho ung thư

Với ddPCR, các nhà nghiên cứu có thể quan sát, định lượng tốt hơn các đột biến, xác định rõ hơn vai trò tiềm tàng của chúng trong ung thư. Các đột biến liên quan đến ung thư thường khó bị phát hiện do nồng độ rất thấp so với DNA bình thường có trong mẫu. Với độ nhạy rất cao 0,0001%, hệ thống QX200 có thể dễ dàng phát hiện và định lượng nồng độ DNA mục tiêu tới 1 bản copy trong tổng số 1 triệu bản copy – điều mà chưa công nghệ nào có thể thực hiện được.

3. Tải lượng virus

Việc xác định chính xác hàm lượng virus là cực kì quan trọng để xác định trạng thái bệnh và đưa ra lộ trình điều trị thích hợp. Hàm lượng virus dao động trong khoảng rất rộng và đôi khi giảm xuống mức rất thấp, điều này có ý nghĩa không hề nhỏ. Việc nghiên cứu bệnh có thành công hay không phụ thuộc nhiều vào độ chính xác và độ lặp lại của việc xác định DNA hoặc RNA của virus.

Hệ thống QX200 có độ nhạy cao để phát hiện số lượng cực nhỏ của vật chất di truyền của virus và phân biệt nó với hỗn hợp phức tạp. Có thể thu được số bản sao thực tế của bộ gen virus bằng cách tạo ra các trình tự DNA bổ sung bằng phiên mã ngược. Cùng với độ chính xác và độ tin cậy cao, hệ thống QX200 cũng cung cấp cho người sử dụng thông lượng cần thiết để xử lý các mẫu với hiệu quả cao.

4. Phân biệt đa dạng hệ gen

Đa dạng số lượng bản sao (CNV) là một đặc điểm nổi bật về sự thay đổi giữa các cá thể khác nhau trong hệ gen người. CNV cũng liên quan đến ung thư, các bệnh thần kinh và miễn dịch tự miễn, các phản ứng phụ của thuốc. Xác định CNV đáng tin cậy thể hiện khả năng quan trọng trong nghiên cứu tiên tiến.

Hạn chế kỹ thuật chính trong đánh giá số lượng bản sao (CN) là khả năng phân biệt, với độ tin cậy thống kê, giữa các trạng thái CN liên tiếp. Về cơ bản, khi trạng thái CN tăng, sự khác biệt về phần trăm trong vật liệu gen mục tiêu giữa các trạng thái giảm, làm cho việc xác định CNV ở các cấp độ cao hơn sẽ khó hơn. Bằng cách phân chia phản ứng khuếch đại qua hàng ngàn giọt, hệ thống QX200 có thể giải quyết các tình trạng số lượng bản sao liên tiếp cao (như năm so với sáu) với mức độ tin cậy thống kê cao.

5. Kết hợp cùng công nghệ Giải trình gen thế hệ mới (NGS)

ddPCR có thể dễ dàng kết hợp vào quy trình chuẩn bị thư viện của giải trình tự thế hệ mới (NGS) để định lượng chính xác và cân bằng thư viện trình tự trên các hệ thống giải trình tự (sequencer). Ngoài việc định lượng chính xác, các ô dữ liệu được tạo ra bởi hệ thống QX200 rất phong phú với các thông tin về thư viện định tính – các phương pháp hiện có chưa làm được. Digital PCR cho phép tải thư viện nhất quán và sử dụng hiệu quả các hệ thống giải trình tự thế hệ mới. Sau khi chạy NGS, Droplet digital PCR cũng có thể được sử dụng để xác nhận các kết quả thu được của NGS, bao gồm các thay đổi về gen như sự đa hình nucleotit đơn, đột biến và sự đa hình số bản copy.

6. Nghiên cứu biểu hiện gen

Với độ nhạy cao, hệ thống QX200 đặc biệt phù hợp với việc phát hiện và định lượng các bản sao hiếm, mang đến hiểu biết rõ ràng hơn về chức năng thực sự của RNA. Với độ chính xác cao, hệ thống QX200 có thể được sử dụng để phát hiện những thay đổi nhỏ trong biểu hiện của một gen mục tiêu giữa các mẫu, cung cấp cái nhìn sâu hơn về những ý nghĩa sinh lý của gen. Khả năng đo lường giá trị tuyệt đối của các phân tử RNA cho biết thêm một mức độ sâu sắc đối với các nghiên cứu biểu hiện gen. Hệ thống ddPCR QX200 không đòi hỏi phải có đường chuẩn.

7. Định lượng bằng EvaGreen

Thông qua việc phân chia giọt và phân tích thống kê, Droplet Digital PCR cung cấp sự định lượng tuyệt đối mà không cần đường chuẩn, mang lại những cải tiến đáng kể cho nhiều ứng dụng đòi hỏi phải phát hiện các bản sao mục tiêu có tỷ trọng thấp hoặc phân biệt sự thay đổi nhỏ giữa các mẫu. Kết hợp Droplet Digital PCR với công nghệ phát hiện EvaGreen cho phép genotyping và phân tích biểu hiện gen cho các gen mục tiêu ở mức thấp. Hệ thống QX200 ddPCR cho phép định lượng tuyệt đối bằng cách sử dụng EvaGreen, tạo ra các thử nghiệm lý tưởng cho các mục tiêu đo đạc DNA, phân tích hàm lượng virus và định lượng vi khuẩn.



Ý kiến của bạn